Exjobbsförslag från företag

Detta är ett uppsatsförslag hämtat från Nationella Exjobb-poolen. Klicka här för att komma tillbaka till samtliga exjobbsförslag.

Förslaget inkom 2010-04-14

Studier av mitokondriefunktion i fibroblaster från ApoE3/4 bärare med en lång poly-T variant i TOMM40 genen.

OBS! ANSÖKNINGSTIDEN FÖR DETTA EXJOBB HAR LÖPT UT.
Bakgrund
Nedsatt glukosmetabolism och mitokondriefunktion uppträder tidigt under förloppet av Alzheimers sjukdom (AD). Man har bl a sett att mitokondriernas morfologi förändras och att mitokondriella enzymer fungerar sämre vilket t ex kan leda till en lägre energiproduktion (ATP). Tomm40 är ett av proteinerna i det mitokondriella importmaskineriet. Tomm40 är lokaliserat till det yttre mitokondriemembranet och bildar en por som proteiner transporetras in igenom. Mitokondrierna behöver importera över 1000 olika proteiner för att de ska fungera korrekt och bland dessa finns komponenter i andningskedjans enzymkomplex. Vi har tidigare visat att amyloid beta peptid (Abeta), som ansamlas i AD hjärnan och utgör ett av kännetecknen för AD, importeras in till mitokondrien genom just Tomm komplexet (Hansson Petersen et al 2008 PNAS 105:13145-13150). Detta var första gången en koppling mellan AD och det mitokondriella importmaskineriet kunde visas. En nyligen publicerad studie visar att en polymorfisk poly-T variant (en lång sekvens av nukleotiden tymin) i TOMM40 genen kan användas för att uppskatta åldern då AD debuterar,”age of onset”, för APOE3 bärare (Roses et al 2009 The Pharmacogenomics Journal 1-10 Dec 22). APOE genen är en sedan länge etablerad riskgen för AD. Roses och medarbetare visade att ApoE3/4 bärare med långa poly-T sekvenser kopplade till ApoE3 allelen hade en ”age of onset” som var sju år tidigare än individer med korta poly-T sekvenser.
Syfte
Vi planerar att idenifiera ApoE3/4 bärare med långa respektive korta poly-T sekvenser och sedan studera om mitokondriefunktionen skiljer sig mellan de två grupperna. Vår hypotes är att individer med långa poly-T sekvenser och tidigare ”age of onset” har försämrad mitokondriefunktion beroende på förändringar i Tomm40 proteinet. Det är t ex möjligt att importen av proteiner in till mitokondrien är störd. Detta kan leda till en försämrad respiration och ökat beroende av glykolys för ATP produktion.
Material
Vi kommer att studera fibroblaster som samlats in från personer som tillhör familjer med en ökad incidens av AD, men utan kända mutationer. Personer som bär på kända mutationer (presenilin, APP) kommer att exkluderas från denna studie eftersom sådana mutationer i sig själva har visat sig påverka t ex Abeta-produktion och känsligheten för celldödsstimuli. Något som i sig kan involvera förändrad mitokondriefunktion.
Planerade experiment
Del 1: Identifiering av personer med långa eller korta poly-T sekvenser i TOMM40 genen (i samarbete med J Brohede och C Graff, Genetik,KI-ADRC).
• ApoE4 allelen är alltid associerad med långa poly-T sekvenser medan ApoE3 allelen kan vara associerad med både långa och korta poly-T. Vi kommer att jobba med fibroblastkulturer med ApoE3/4 genotyp. Dessa cellkulturer identifieras i vår samling innan de kan genotypas med den poly-T assay som beskrivs nedan.
• För att identifiera personer med långa eller korta poly T sekvenser i TOMM40 genen avser vi att utveckla en PCR baserad assay som kan amplifiera poly-T regionen genom användandet av specifika primers. Klassificeringen av poly-T längden görs med fragmentanalys av PCR produkten genom att använda ett kapillärbaserat sekvenseringssystem.
• Vi avser att identifiera minst fem fibroblastkulturer med långa poly-T och fem med korta poly-T.
Del 2: Studier av mitokondriefunktion i fibroblaster från individen valda i ”Del 1”.
• Morfologi
Mitokondriernas morfologi studeras med elektronmikroskopi (core facilitet finns vid KI)
• Mitokondriemembran potential (?mit)
Cellerna odlas i speciella skålar där mitten består av ett täckglas. Cellerna färgas med TMRM som är en fluorescent probe som detekterar ?mit. ?mit mäts under ett konfokalmikroskop som är utrustat för live-cell imaging.
• Syrekonsumtion (respiration)
Mäts på celler i suspension med hjälp av en Clark elektrod.
• ATP produktion
Mäts med en luciferas baserad assay
• ROS (reaktiva syreradikaler)
Bildningen av syreradikaler mäts i en FACS maskin i celler inmärkta med den fluorescenta proben CM-H2DCFDA, som fluorescerar när den är oxiderad
• Protein import
Effekter på mitokondriell proteinimport kommer att studeras i en import assay där vi använder mitokondrier isolerade från de olika cellkulturerna. Denna assay finns etablerad på vårt lab, se Hansson Petersen et al 2008.

Betydelse
Resultaten från dessa studier kommer att visa om den långa poly-T varianten i TOMM40 genen resulterar i ett Tomm40 protein med förändrad funktion. Detta skulle i så fall kunna vara en förklaring till varför dessa individer har en lägre ”age of onset” och peka på en viktig roll för mitokondrierna i AD patogenesen.


  GÅ TILL XJOBB.NU FÖR FULLSTÄNDIG INFO OM DETTA EXJOBB




Informationen om uppsatsförslag är hämtad från Nationella Exjobb-poolen.